Báo cáo khoa học kết quả thử nghiệm nhuộm Hóa mô miễn dịch tại Bệnh viện Việt Đức từ tháng 10/2000 - 4/2001

Chủ nhật - 18/09/2011 11:45
Nhóm tác giả (gồm các bác sĩ Phạm Kim Bình, Trương Nam Chi, Nguyễn Phúc Cương, Trịnh Quốc Hoàn) đã trình bày 15 trường hợp nhuộm hoá mô miễn dịch được làm tại khoa Giải phẫu bệnh- bệnh viện Việt đức từ tháng 10 năm 2000 đến tháng 6 năm 2001 và đã mang lại kết quả tốt, giúp cho việc chẩn đoán phân biệt 1 số khối u khó xác định nguồn gốc.. Các tác giả cũng trình bày những ưu điểm và hạn chế của phương pháp này, đồng thời còn đưa ra một số lý thuyết cơ bản và chi tiết phương pháp nhuộm miễn dịch đã được thực hiện.
Báo cáo khoa học kết quả thử nghiệm nhuộm Hóa mô miễn dịch tại Bệnh viện Việt Đức từ tháng 10/2000 - 4/2001

 

Đặt vấn đề :

Hoá mô miễn dịch (HMMD: Immunohistochemistry) là sự kết hợp giữa hai ngành mô bệnh học (Histopathology) và miễn dịch học (Immunology). Kỹ thuật HMMD được dùng không những chỉ để xác định một mô có hoặc không có kháng nguyên (KN) đặc hiệu, mà còn để xác định tình trạng kháng nguyên của những tế bào đặc hiệu trong mô và vị trí của KN trong tế bào. Nhờ đó có thể xác định dòng tế bào, xác định rõ tính chất sinh học của quần thể tế bào trong cùng một dòng, và chức năng khác nhau của các loại tế bào, thậm chí còn có thể xác định các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn và vi rút nữa (1).
Chìa khoá chính trong HMMD là phản ứng đặc hiệu của kháng thể (KT) với KN. Mặc dù được áp dụng rộng rãi với nhiều 
nguyên lý khác nhau trong nhiều lĩnh vực khác nhau, nhưng trong giải phẫu bệnh ngoại khoa, HMMD có tác dụng rất lớn và sâu sắc trong việc chẩn đoán giải phẫu bệnh (2).
Giải phẫu bệnh ngoại khoa vốn là một ngành có tính chất chủ quan cố hữu. Mặc dù đã có nhiều tiêu chuẩn mô bệnh học " cơ bản" dùng cho chẩn đoán, song trong thực tế, sự trùng lặp và giống nhau của các thương tổn, cũng như có nhiều thương tổn không điển hình làm cho việc chẩn đoán mô bệnh học gặp nhiều khó khăn, khó đi đến chẩn đoán xác định hoặc khó thống nhất giữa các nhà giải phẫu bệnh với nhau. Vì thế đã từ lâu các nhà giải phẫu bệnh trên thế giới đã tìm nhiều phương pháp giúp chẩn đoán phân biệt như mô hoá học (histochemitry), mô-enzym học (histoenzymology), miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence), hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry), lai tại chỗ (hybridation in situ)... Hoá mô miễn dịch là một kỹ thuật hiện đại, mới được áp dụng tương đối rộng rãi ở những nước tiên tiến vì có độ chính xác cao, nhưng có nhược điểm là khá đắt tiền nên các nước nghèo khó có điều kiện áp dụng. Nhờ sự hợp tác giữa bệnh viện Việt Đức với bệnh viện trường đại học Limoges (CVH Pháp), với sự giúp đỡ tận tình của giáo sư CATAZANO và kỹ thuật viên CHANTAL (Khoa giải phẫu bệnh thuộc viện trường Limoges) mà chúng tôi đã thực hiện thành công một số trường hợp giúp chẩn đoán xác định bản chất của một số ung thư. Sau đây xin trình bày chi tiết:

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

Những trường hợp trên tiêu bản mô bệnh học thông thường khó phân biệt giữa ung thư biểu mô (carcinoma) với ung thư liên kết (sarcoma), chúng tôi dùng kháng thể KL1

(cytokeratin) và vimentin, hoặc không phân biệt được hai loại trên với u lymphô ác tính (ML: malignant lymphoma) chúng tôi dùng thêm kháng thể LCA (leucocyte commun Antigene). Để dễ dàng nắm được phương pháp tiến hành, chúng tôi xin nhắc lại một số nguyên lý cơ bản của HMMD.

Hoá mô miễn dịch là một kỹ thuật thuộc mô bệnh học, cho phép chứng minh tính đặc hiệu của các cấu trúc mô và tế bào trên tiêu bản mô học bằng cách dùng các kháng thể đánh dấu đặc hiệu để phát hiện những đặc tính kháng nguyên trên bề mặt tế bào. Tất cả các kỹ thuật đánh dấu miễn dịch đều dựa trên cơ sở tác động qua lại đặc hiệu của kháng nguyên- kháng thể. Các kháng thể là các sản phẩm của động vật được miễn dịch hoá với một chất ngoại lai là kháng nguyên. Có hai loại kháng thể: đơn dòng và đa dòng. Các kháng thể, dù là đơn dòng hay đa dòng đều biểu hiện tính đặc hiệu cao đối với mối liên kết với kháng nguyên, và người ta lợi dụng chính đặc điểm đó để áp dụng vào phản ứng hoá mô miễn dịch. Hơn nữa từ các đặc tính hoá mô cho phép sự khuyếch đại các dấu hiệu. Trong số các hệ thống đánh dấu miễn dịch làm khuyếch đại mối liên kết kháng nguyên- kháng thể, người ta có thể kể đến kỹ thuật Peroxydase-Anti-peroxydase (PAP) và kỹ thuật Biotin-Strept-Avidine (BSA). Cả hai hệ thống đều hoạt động bằng cách gắn một liên hợp enzym có khả năng sinh ra một kết tủa bắt màu với sự có mặt của cơ chất và một chất sinh màu ( vd:H2O2 +DAB) vào phức hợp kháng thể tiên phát và kháng nguyên. Người ta cũng có thể làm cho thấy rõ và khu trú các kháng nguyên người như: kháng nguyên màng tế bào, các hocmôn, các enzym trên các tiêu bản mô đã được cố định theo các kỹ thuật thông thường và đúc nến hay cắt lạnh. Các tiêu bản được khử nến rồi được xử lý bằng một dung dịch ôxy già để phá huỷ tất cả các hoạt tính peroxydase nội sinh đối với những trường hợp dùng peroxydase để đánh dấu. Sau đó người ta dùng huyết thanh bình thường hoặc phong toả các vị trí gắn kết không đặc hiệu. Sơ đồ phản ứng gồm 4 giai đoạn, sau mỗi giai đoạn được rửa trong dung dịch đệm (1):

- Giai đoạn 1: vùi tiêu bản với kháng thể tiên phát đặc hiệu, là kháng thể đơn dòng được pha chế từ huyết thanh chuột hoặc đa dòng từ thỏ hay dê.
- Giai đoạn 2: vùi tiêu bản với kháng thể liên kết kháng immunoglobulin.
- Giai đoạn 3: dùng phức hợp hoà tan của PAP để gắn vào các vị trí tự do của kháng thể liên hợp.
- Giai đoạn 4: Làm hiện rõ phức hợp kháng nguyên-kháng thể-enzym bởi một chất màu nâu đỏ trên các vị trí kháng nguyên với sự có mặt của peroxydase hoặc Diaminobenzidin (DAB) + H2O2.
Cụ thể các bước như sau (có nhiều phương pháp cụ thể, nhưng chúng tôi áp dụng phương pháp đang được áp dụng tại khoa giải phẫu bệnh, viện trường Limoges):
Các khối nến được cắt lại với độ dày 3m, sau đó tẩy nến bằng toluen 2 lần, mỗi lần 10 phút; khử toluen bằng cồn 100 (210 phút); nước cất: 3 phút; tráng dung dịch PBS.
- Ngâm tiêu bản trong dung dịch đệm citrat để ở lò vi sóng 3 lần 5 phút.
- Để nguội ở ngoài 20-30 phút;
- Ngâm trong dung dịch PBS trong thời gian 5 phút;
- Ngâm trong dung dịch Méthalon + H2O2 trong 5 phút; cách pha như sau:
+ 90 ml Méthalon + 10 ml H2O2 110 vol.
- Rửa nước cất 2 lần, mỗi lần 2 phút.
- Ngâm trong dung dịch BSA trong 30 phút: cách pha như sau:
+ 0,25 g BSA cho 100ml PBS (dùng cho 2 tiêu bản)
* Giai đoạn 1: Phủ kháng thể đặc hiệu lớp 1 cho kín tiêu bản; tiêu bản đặt nằm ngang trên giá, bên dưới có hộp đựng nước. Thời gian ủ là 45 phút. Cách pha:
+ LCA: tỷ lệ 1 microlit LCA trên 25 mocrolit BSA;
+ KL1: tỷ lệ 1 microlit KL1 trên 50 microlit BSA;
+ Vimentin: 1 microlit Vim trên 25 micrrolit BSA;
- Ngâm trong dung dịch PBS 3 lần, mỗi lần 3 phút;
- Tráng bảng dung dịch PBS rồi lau sạch xung quanh;
* Giai đoạn 2: phủ kháng thể đặc hiệu lớp 2 : P161 trong 30 phút. Cách pha:
+ Dung dịch BSA: 100 microlit
+ Huyết thanh người: 12 microlit
+ Kháng thể P161: 8 microlit
(trung bình mỗi lần cần tổng số 100 microlit)
- Ngâm trong dung dịch PBS 3 lần, mỗi lần 3 phút; có thể kéo dài đến 1 giờ;
- Tráng bằng dung dịch BSA rồi lau sạch chung quanh;
* Giai đoạn 3: Phủ kháng thể lớp 3: P217 trong 30 phút. Cách pha:
+ Dung dịch BSA: 100 microlit
+ Huyết thanh người: 12 microlit
+ Kháng thể P217: 8 microlit
- Ngâm trong dung dịch PBS 3 lần, mỗi lần 3 phút;
- Tráng qua dung dịch BSA để lau sạch chung quanh;
* Giai đoạn 4: Phát hiện kết quả:
- Phủ 5 phút trong dung dịch 10 mg DAB + 10 ml Tampon Tris (TBS) +2 giọt NaOH 3% + 3 microlit H2O2, khuấy đều thật kỹ rồi lọc sạch
- Rửa nước cất 3 phút (tráng sạch nhiều lần);
- Nhuộm Hematoxylin 2 lần, mỗi lần 1 phút (nếu bắt màu xanh là được);
- Rửa nước chảy 5 phút;
- Nhúng qua cacbonat liti bão hoà để lấy màu xanh;
- Rửa nước chảy 10 phút;
- Cồn 90,4 phút; còn 100: 5 phút  2 lần; toluen 5 phút  2 lần; lên kính.
Cách pha các dung dịch đệm:
1. Dung dịch Tampon cirtat:
+ Dung dịch A: axit citric 0,1 M (C6H8O7. H2O): 21,01 g cho 1000ml nước cất. (Bảo quản trong tủ lạnh);
+ Dung dịch B: Citrat Natri 0,1M (C6H5O7. 2H2O):29,41 g ch 1000ml nước cất. ( Bảo quản trong tủ lạnh)
Hai dung dịch này khi pha xong phải có độ pH=7, nếu cao quá hoặc thấp hơn thì phải điều chỉnh bằng dung dịch axit hoặc kiềm
- Dung dịch đệm citrat thực hành trong quá trình nhuộm:
1 ml dd A + 49 ml ddB, thêm nước cất vừa đủ 500ml (tức 450ml).
2. Dung dịch dệm PBS: - Dung dịch mẹ:
+ 15,20 g K2HPO4 (hydrogenophosphate 2 potassium)
+ 1,8 gKH2PO4 (dihydrogenophóphate potassium)
+ 87,66 g NaCl
pha trong 1000ml nước cất, yêu cầu pH = 7,5 hoặc 7,6;
- Dung dịch thực hành pha theo tỉ lệ 1/10
3. Dung dịch dệm Tris (TBS): Dung dịch mẹ:
+ dd A: Tris: 60,55g/ 1000 ml nước cất; pH =7,6;
+ dd B: 87,66 g NaCl/ 1000ml nước cất , pH = 7,6
- Dung dịch thực hành
100 ml dd A + 100 ml dd B + ml nước cất; pH = 7,6

Kết quả :

Từ tháng 10/2000 đến tháng 6/2001, Khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Việt Đức đã thực hiện được 15 xét nghiệm hoá mô miễn dịch, gồm:

Số GPB Lâm sàng GPB với HE Kháng thể HMMD
N.272 U thận T  Saccôm hay cacxi? Vim-KL1+  Cacxinôm TB thoi
N.271 U ngoài tuỷ Cacxi hay saccôm? KL1-  Leiomýoarcome
N.235 U sau FM Cacxinôm thận? KL1-,Vim+  Pericytome ác tính
N.1358 Hạch nách ML hay saccôm? KL1+,Vim+  Synovíoarcome(*)
N.475 Lao hậu môn ML hay cacxinôm? KL1+,LCA-  Adenocarcinome
N.515 Hạch di căn ML hay cacinôm? LCA-,KL1+  Di căn Adenocarc
N.1414 Phì đại TLT Cacxi hay cacxinôm?  KL1-,Vim+ Sarcome TB thoi
N.3966 Hồi tràng Cacxinôm hay ML?  CLA+,KL1-  Lymphome ác
N.1266 U bụng + vú Cacxinômanaplasic Vim+,KL1, Mesenchymome ác
N.1284 Lần 2   LCA- Mesenchy.malin
N.1391 U cẳng tay Ung thư loại gì?  Vim+,KL1- Leiomýoarcome
N.3157 U trán +xg sọ Saccôm màng não? Vim+,LCA-  SarcomEwing
N.3433 U tá tràng Cacxinoit hay tuỵ? KL1+,Chr+  Carcinoide(*)
N.602  Loét nghi K ? Cacxinôm hay ML? KL1-,LCA- Loét xơ mạn
N.3901 Phổi (PY) Tắc mạch ối KL1+  Tắc mạch ối

(*): 2 ca này đã gửi qua Limoges bằng mạng Internet để kiểm tra và bạn đã thống nhất chẩn đoán; ML: Lymphome ác tính; Chro: Chromogranin (KT thần knh); Cacxi: Cacxinôm

Trong bảng kết quả này có 6 trường hợp khó phân biệt giữa ung thư biểu mô (carcinoma) với ung thư liên kết (sarcoma); 4 trường hợp khó phân biệt giữa UTBM với u lymphô ác; 2 trường hợp khó phân biệt giữa UTLK với u lymphô ác nếu chỉ căn cứ trên tiêu bản nhuộm HE. Ví dụ như trường hợp số N.602 là một ổ loét dạ dày, hơi cứng, lâm sàng và đại thể nghi ngờ ung thư. Trên tiêu bản nhuộm HE, chúng tôi thấy ở đáy loét và bờ loét có nhiều tế bào nhỏ không rõ bào tương, nhân rất xẫm màu khó phân biệt với một u lymphô ác tính với một cácxinôm (ung thư biểu mô : UTBM) không biệt hoá. Chúng tôi phải dùng KL1, nếu dương tính là tế bào của UTBM. Trong trường hợp này KL1 âm tính nên đã loại trừ một UTBM. Để xác định những tế bào nghi ngờ ung thư tế bào lymphô, chúng tôi dùng LCA, nhưng trong trường hợp này cũng âm tính nên chúng tôi loại trừ u lymphô ác tính. Vậy chỉ có thể chẩn đoán là loét xơ mãn dạ dày, không có ung thư. Trường hợp khác, số N.3157, là một u não ở thuỳ trán ăn vào xương sọ, trên tiêu bản nhuộm HE thấy nhiều đám tế bào hình tròn, nhân xẫm màu, xâm nhập vào xương sọ nên nghĩ đến u màng não ác tính hay u lymphô ác tính? HMMD với LCA âm tính chứng tỏ không phải u lumphô, còn Vim dương tính nên nghĩ đến saccôm. Bằng các phản ứng hoá mô như PAS và ngấm bạc (kỹ thuật Gordon Sweet) nên đã xác định là Saccôm Ewing xuất phát từ tuỷ xương xâm nhập vào màng não.

Bàn luận :

Bản kết quả trên 15 trường hợp trong số rất nhiều trường hợp mà trên tiêu bản thông thường rất khó xác định là loại ung thư gì, chỉ có nhờ HMMD chúng tôi mới định hướng được loại ung thư. Tuy vậy, đây cũng chỉ là những kháng thể thông thường, cơ bản để phân loại tế bào. Bởi vì như chúng ta đã biết trong bào tương của mỗi tế bào có một loại sợi riêng biệt, nó tạo nên bộ khung của tế bào. Mỗi loại sợi có phản ứng đặc hiệu với một loại kháng thể riêng. Người ta biết được có 5 loại sợi bào tương dương tính với 5 loại kháng thể sau đây: Kêratin,Vimentin, Desmin, Neurofolament (FN), Glial Fibrillary Acidic Proteine (GFAP). Các loại ung thư biểu mô (carcinoma) thể hiện Kêratin, ung thư liên kết (sarcoma), UT sắc tố (melanoma) và u Lymphô ác tính (Lymphomemalin: LM) đều thể hiện Vimentin, U sinh cơ hiện diện cả Desmin và Vimentin, U thần kinh đệm phần lớn dương tính với GFAP, u thần kinh ngoại biên phần lớn thể hiện NF. Có một số u thể hiện đồng thời cả 2 loại sợi bào tương, nhưng độ dương tính có thể khác nhau (2). Ngoài các kháng thể cơ bản trên, do sự phát triển ngày càng ồ ạt của kỹ thuật HMMD mà ngày nay có hàng trăm kháng thể khác nhau và vì giá thành của các kháng thể rất đắt, cho nên việc dùng kháng thể nào là một vấn đề cần được xem xét một cách cẩn thận, lô gíc và sáng suốt. Trước hết các Test HMMD cần được xác định một cách cụ thể, phải dựa trên cơ sở lâm sàng và hình ảnh trên tiêu bản nhuộm HE để góp phần thêm vào chẩn đoán phân biệt. Câu hỏi cần được đặt ra là kháng thể nào sẽ giúp ta xem xét dương tính hay âm tính là quan trọng. Mặt khác, bác sĩ GPB cần phải hiểu biết cả về cơ chế, kiểu bắt màu, các bước tiến hành, tác dụng của nó và cả những sai sót, hạn chế trong quá trình làm tiêu bản. Ví dụ LCA thì bắt màu ở màng tế bào, còn với kháng thể Keratin và Vimentin thì phải tìm trong bào tương. Khi sự bắt màu xảy ra ở vị trí không thích hợp thì kết quả không được tính. Một trong những bước quan trọng trong khâu kỹ thuật là chuẩn bị bệnh phẩm. Các bệnh phẩm được chuyển xuống từ phòng mổ rồi được cố định bằng Bouin hoặc formol 10%, không biết rõ độ pH. Bệnh phẩm cũng không được chuyển đúc ngay mà thường là phải đợi tất cả các bệnh phẩm trong ngày để làm cùng một lúc. Ngay cả quá trình chuyển đúc cũng khác nhau về thời gian, vào những ngày nghỉ cuối tuần thì thời gian cũng dài hơn, kích thước các mảnh cắt cũng khác nhau. Tất cả những vấn đề này đối với những tiêu bản thông thường thì không ảnh hưởng nhiều, nhưng với HMMD thì là tai hoạ. ảnh hưởng của các dung dịch cố định khác nhau lên các kháng nguyên thì chưa rõ , nhưng có điều rõ ràng là thời gian chưa cố định càng dài thì kháng nguyên càng bị ảnh hưởng. Do đó cần phải cố định tối đa là trước 24 giờ. Ngoài ra đây là một kỹ thuật cao, đòi hỏi sự chính xác lớn, và có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trong khi tiến hành kỹ thuật, do đó đòi hỏi kỹ thuật viên phải thông thạo, tỉ mỉ, chính xác hơn nhiều so với các phương pháp nhuộm thông thường.

Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng HMMD có vai trò rõ rệt trong chẩn đoán giải phẫu bệnh; sự cần thiết đối với nghiên cứu HMMD để giúp giải quyết vấn đề chẩn đoán (như đối với những khối u không rõ nguồn gốc) hoặc để xác định phương pháp điều trị (như các khối u thể oestrogen và progesteron). Từ năm 1985, một nghiên cứu đã báo động về tỉ lệ chẩn đoán nhầm các khối u giảm biệt hoá khi các tiêu chuẩn hình thái học theo quy ước được dùng trong phân loại khối u (Gatter KC. Vcs, 1985). Sau khi dùng phương pháp HMMD để đánh giá lại thì trong số 120 khối u như vậy có đến 50% phải thay đổi chẩn đoán. Trong một nghiên cứu riêng biệt trên 200 trường hợp (Leong AS-Y, Wright J, 1987) cũng kết luận rằng HMMD đóng góp vào chẩn đoán cũng với tỷ lệ tương tự như trên. Trong một số nghiên cứu sau đó trên 500 khối u ít biệt hoá với tế bào hình tròn và hình thoi (Leong AS, Wannakrirot P,1992), HMMD đã cung cấp một chẩn đoán cuối cùng trong 70% các u tế bào tròn và 92% các u tế bào hình thoi. Khi xem xét lại các chẩn đoán trong thời gian một năm. Banks (1993) đã kết luận rằng HMMD là cần thiết cho chẩn đoán trong 55% trường hợp có nhuộm đặc biệt. Qua đó chúng ta có thể dự đoán rằng Giải phẫu bệnh ngoại khoa sẽ phải cần đến HMMD để chẩn đoán khoảng 10-25% số khối u. Chính vì vậy mà mỗi phòng xét nghiệm GPB cần phải hiểu rõ tính ưu việt của HMMD và cả những giới hạn cũng như về kỹ thuật và kinh nghiệm chẩn đoán (2).

Trên đây là những giới thiệu bước đầu về HMMD áp dụng trong giải phẫu bệnh ngoại khoa. Đây là một vấn đề hoàn toàn mới mẻ, trên thế giới đang áp dụng và sẽ có nhiều cải tiến để mỗi ngày một hoàn hảo hơn. Khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện Việt Đức cũng chỉ mới bắt đầu áp dụng trên một số trường hợp và thấy kết quả tốt. Chúng tôi hy vọng trong tương lai khi kinh tế phát triển hơn, nhà nước và người bệnh đầu tư nhiều hơn, chúng tôi sẽ mua được nhiều loại kháng thể hơn để giúp chẩn đoán giải phẫu bệnh chính xác hơn.

Tài liệu tham khảo

1- Nguyễn Phúc Cương (1995): "Recherche epidemique et histopathologique du SIDA" Rapport scientifique à l'AUPELF – UREF.
2- Cote RJ and TAYLOR CR (1996) : "Immunohistochemistry and related marking techniques " in ANDERSON'S PATHOLOGY by Ivan Damjanov and James Linder;Mosby, New York, Tenth edition, vol2, p . 136-175.

Từ khóa: n/a
Tin mới
Thống kê truy cập

Đang truy cậpĐang truy cập : 19


Hôm nayHôm nay : 608

Tháng hiện tạiTháng hiện tại : 30268

Tổng lượt truy cậpTổng lượt truy cập : 1665455

Công ty Cổ phần Biotech Việt Nam
Địa chỉ: 28/119, Hồ Đắc Di, Nam Đồng, Đống Đa, Hà Nội
Tel: (84-4) 8582 2374 / (84-4) 3533 5097 Fax: (84-4) 3533 5097
Design by hoangbinh@yahoo.com